| | | 改进dUTP缺口末端标记技术法的操作体会
| | 医学论文集［摘 要］ 通过对多种石蜡组织切片运用dUTP缺口末端标记技术(TUNEL)法检测细胞凋亡，在进行前期处理、冲洗、减少非特异性染色、蛋白酶K消化时间、显色、复染、封片等方面总结了一定经验。
［关键词］ 缺口末端标记技术；细胞调亡；组织切片
末端脱氧核苷酸转移酶介导的医学论文集dUTP缺口末端标记技术(Terminal deoxyribonucleic transferasemediated dUTP nick endlabeling,TUNEL)是依据凋亡细胞内内源性核酸内切酶被激活而将自身染色体DNA切断成缺口或含180 bp～200 bp的医学论文集3’OH末端片段这一特点，利用末端脱氧核糖核酸转移酶(TdT)将标有标记物(如地高辛、生物素或荧光素等)的脱氧核苷酸(如 dUTP)转移到3’OH末端，再进行显色显示凋亡细胞。由于正常细胞或繁殖细胞没有DNA断裂，亦无3’OH末端，故不被显色。TUNEL法检测细胞凋亡是目前国内外学者所广泛采用的一种先进方法，但不易掌握。我们在经过反复摸索后，成功应用该法检测了多种石蜡组织切片的细胞凋亡。现谈谈在TUNEL法操作过程中需要注意的一些环节。
1 前期处理
为确保离体组织的凋亡检测效果，值得高度重视的是离体组织固定须在组织离体后15 min内进行，否则组织发生自溶就会出现DNA的断裂，影响检测结果。我们在工作中应用10%中性甲醛作为固定剂，其在保持组织细胞结构的完整性、组织渗透性［1］上的效果优良。适宜的固定时间为常温条件下4 h～24 h，根据组织大小做相应调整。切片要求平整，厚度以4 μm～5 μm［2］为宜。尽量避免因刀的缺口造成组织划痕，以免影响组织细胞的形态完整，出现非特异性着色。56 ℃～60 ℃恒温箱里烤片4 h，可保证不脱片，但需谨防高温烤片对组织的破坏，因为在高温干燥条件下可以加速组织切片中的氧化。对于切片的保存，许多大的实验室研究人员习惯将组织蜡块连续切片后长期保存在室温条件下，切片后的组织在室温下长期保存也会加速组织切片的氧化，所以在实际工作中可以采用蜡封切片来避免氧化损失以便长期保存。脱蜡务必干净，当室温低于25 ℃时，笔者把二甲苯置入37 ℃温箱内，每缸10 min，以保证脱蜡彻底，否则可能导致染色结果的异常。
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